转染sirna的用量怎么算 如何选择siRNA转染试剂
如何选择siRNA转染试剂现在做转染试剂的公司很多。3.设立阳性对照组，用靶向siRNA的无血清培养基EntransterE电转染试剂如GAPDH或LaminA/C转染看家基因，然后用westernblotting或mrna定量检测基因表达。
以EntransterE电转染试剂为例。八。电转染实验中如何设置正确的siRNA实验对照组？1.设置空白对照组，检测细胞生长状况。2.设立阴性对照组，无血清培养基电转染试剂阴性siRNA。3.设立阳性对照组，用靶向siRNA的无血清培养基EntransterE电转染试剂如GAPDH或LaminA/C转染看家基因，然后用westernblotting或mrna定量检测基因表达。
用高纯度、无菌、无污染的DNA进行电穿孔实验。质粒DNA不需要内毒素，OD值为1.82.0。不建议用微量核酸制备试剂盒制备DNA，因为它可能含有高水平的内毒素。不要使用仅通过乙醇沉淀纯化的DNA。乙醇沉淀法中残留的盐会引起电流的变化，对电穿孔产生负面影响。DNA的推荐浓度范围是15毫克/毫升。使用高浓度的DNA可能导致与细胞混合不均匀。
这里面有很大的矛盾:一是siRNA干扰目的基因，其原理是与目的基因转录的mRNA配对，降解其表达；MiRNA是3端几个碱基和几个碱基的组合，调节基因表达水平；第二，siRNA是降解的目标基因；而miRNA是受调控的，所以有正调控和负调控两种情况，即可能降低其靶基因的表达，但也可能增加其靶基因的表达。当然现在只发现了一千个基因，有以下几种情况:一个基因可能被多个Mirna调控，或者一个Mirna调控多个基因，这一块的研究还在进行中；
hepg2很难转换，也可以直接用lipo，效率稍低。效率最高的是构建病毒载体感染它，如果用电转化效率还不错。我们之前用的是Lipo，说明书要求细胞密度要在70%左右。同时要注意转染后46小时更换培养基。后来我们实验室换了RFectsRNATransfectionReagent试剂，细胞密度45%左右，siRNA终浓度定为10nM。
有50纳米和100纳米四个梯度，每个梯度最好打两个孔。通常，在转染前一天放置平板。用于稀释siRNA和转染剂的培养基必须是无血清培养基，因为血清的存在会干扰siRNA和转染剂的混合，影响转染效率。在转染后48小时收获细胞用于qPCR基因水平检测，或者在转染后72小时收获细胞用于蛋白质印迹蛋白水平检测。
1。设置空白对照组，检测细胞生长状况。2.设立阴性对照组，无血清培养基电转染试剂阴性siRNA。3.设立阳性对照组，用靶向siRNA的无血清培养基EntransterE电转染试剂如GAPDH或LaminA/C转染看家基因，然后用westernblotting或mrna定量检测基因表达。
siRNA转染效率不理想的原因如下:1 .siRNA纯度太低，溶解时注意避免RNase污染。使用DEPC处理过的消耗品和试剂；2.siRNA转染试剂复合物浓度较低，需要优化转染效率，使用合适的转染试剂剂量；3.血清影响转染效率。配制混合物时，不能含有血清。培养中可以有血清，但不能有抗生素；4.脂质体转染试剂保存不当，试剂失效，应在4℃保存。
2.细胞密度不好。调节细胞密度，直到转染时汇合为20.40%。用siRNA成功转染的细胞将产生靶基因表达的下调，但未成功转染的细胞将不受影响。这时候转染效率和总细胞数就很重要了。通常，当细胞数量少时，转染效率高。由于siRNA沉默时间性的影响，qRTPCR只能在转染后48小时检测到，蛋白只能在转染后4872小时检测到。
Q9:刚开始实验，准备把RNAi片段转入染色体稳定表达。我不知道什尔纳和siRNA哪个更好更有效率。另外，把两个针对不同基因的shRNA放在一个载体里会不会互相影响？A9:稳定转染当然是shRNA。关于一个载体中的两个shrna，涉及到两个shrna的表达和加工。关键是两个shrna都需要顺利表达，这和你的载体以及载体中两个shrna的排列有关。
Q10:慢病毒用于包装siRNA转染细胞。如何保证成功转染细胞的稳定性？这个细胞最多能稳定传几代？A10:我明白你的稳定性意味着RNAi效应也出现在子细胞中。瞬时转染的siRNA在培养和传代过程中会被降解和稀释，甚至消失。如果后代中永久需要RNAi，就需要将相关的siRNA基因整合到细胞基因组中并表达。
通常建议用于稀释siRNA和转染试剂的培养基为无血清培养基。而我们课题组使用的BIODAI，转染前后不需要更换无血清培养基。如遇特殊情况，转染前可更换新鲜含血清培养基，以防止转染后孵育阶段细胞密度过高、营养不足而导致细胞死亡。1.设计和合成有效的siRNARNAi的核心需要siRNA与相应的mRNA有效结合和作用。
可以搜索siRNA的设计，优选经过验证的siRNA或设计多对siRNA。需要强调的是，要同时设置阴性对照排除非特异性沉默和阳性对照来确认整个实验系统的有效性。2.注意合成siRNA的纯度和工作浓度。需要注意的是，合成siRNA必须选择高纯度的siRNA，siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。siRNA的工作浓度与siRNA的设计、细胞类型和靶基因有关。
siRNA的设计是什么？以前人们一般用长dsRNA作为基因沉默的工具，后来发现长链dsRNA的特异性很差。它不仅能激活导致非特异性RNA降解的RnaseL，还能激活依赖dsRNA的蛋白激酶R (protein: kinase: R，PKR)。PKR可以磷酸化和灭活翻译起始因子e:IF2，从而抑制翻译起始。后来发现小于30bp的dsRNA可以有效的引起基因沉默。
进一步研究表明，抑制作用最强的是长度为21bp、3’端有两个突出碱基的siRNA。但RNAi技术要求siRNA反义链与目的基因序列之间有严格的碱基配对，单碱基错配会大大降低沉默效果，而siRNA还可以沉默与其同源的其他基因(也称交叉沉默)，因此序列问题在siRNA的设计中非常重要。要求设计的siRNA只能与目的基因有较高的同源性，与其他基因的同源性尽可能小。
现在做转染试剂的公司很多。我们实验室以前用过小核酸转染试剂RFect，转染阳性率高，细胞死亡少。实验相当成功。Dochado市面上的转染试剂种类繁多，商家还在不断推陈出新。如此多的选择难免让人无所适从。怎样才能找到最合适的产品？转染试剂的选择主要取决于细胞类型、细胞种类和下游实验。不同的细胞系自然需要不同的转染条件。
此外，神经元和巨噬细胞也令人头痛，很难通过标准方法将siRNA转染到它们体内。无论哪种情况，经验数据都有不可替代的价值，查阅文献，与其他研究者交流，可以获得有价值的信息。当然，我们也可以在供应商提供的资料中查看成功转染的细胞类型，虽然在这些材料中可能没有关于siRNA转染的具体信息，但是知道哪些细胞已经被转染试剂成功转染是有帮助的。
